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內(nèi)皮素-1（一種21個(gè)氨基酸分子組成的多肽）是目前所知的zui有效的血管收縮劑。1985年Rubanyi研究小組發(fā)現(xiàn)了一種多肽并將其命名為內(nèi)皮源性收縮因子（EDCF），之后Yanagisawa將其分離、測(cè)序、克隆，并命名為內(nèi)皮素，而且認(rèn)為它是zui有效的血管收縮劑，這使得人們了解到它更多的生理功能。內(nèi)皮素-1（ET-1）是哺乳動(dòng)物三種血管活性肽家族中的一種，這三種血管活性肽還包括內(nèi)皮素-2和內(nèi)皮素-3。這兩種相關(guān)多肽的2和6號(hào)位的氨基酸與ET-1的不同。這些基因可以產(chǎn)生三種前肽，之后可分解成三個(gè)含39個(gè)氨基酸分子的內(nèi)皮素分子。我們可以獲得一系列內(nèi)皮素多肽和前肽家族的功能概述和分子生物學(xué)知識(shí)。ET-1對(duì)平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞有強(qiáng)烈效應(yīng)，并且它也參與很多疾病過(guò)程，特別是心血管疾病。ET-1在充血性心力衰竭、腎衰竭和肺動(dòng)脈高血壓中有重要作用。人的ET-1和牛、犬、鼠、豬、兔和大鼠的ET-1有相同的氨基酸序列。

此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒，整個(gè)試劑盒使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑，zui終溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中ET-1的量成正比。測(cè)量范圍：0.78～100pg/ml

IBL的ET-1 ELISA試劑盒可用于人血清、EDTA血漿、細(xì)胞培養(yǎng)液上清和組織提取液中ET-1的定量檢測(cè)。

1）  包被板：微孔用抗ET^15-21兔IgG包被，96孔。

2）  濃縮型酶標(biāo)抗體：HRP標(biāo)記的抗ET-1兔IgG Fab片段，30倍濃縮，0.4ml。

3）  標(biāo)準(zhǔn)品：ET-1，0.5ml×2。

4）  EIA緩沖液：內(nèi)含1%的BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，30ml。

5）  用于稀釋酶標(biāo)抗體的稀釋液：內(nèi)含的1%BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，12ml。

6）  顯色劑：TMB底物液，15ml。

7）  終止液：1N的H2SO4，12ml。

8）  濃縮洗滌液：內(nèi)含0.05%吐溫的磷酸緩沖液（40倍濃縮），50ml。

1）  酶標(biāo)儀（450nm）

2）  微量移液器和取樣吸頭

3）  帶刻度的量筒與燒杯

4）  蒸餾水

5）  溫育器（37℃±1℃）

6）  冷床箱（4℃）

7）  坐標(biāo)紙（log/log）

8）  吸水紙

9）  用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的試管

10）              洗滌瓶

11）              酶標(biāo)抗體稀釋的一次性試管

12）              提取用的Sep-Pak C-18柱和試劑，見“樣品處理應(yīng)注意的問(wèn)題”

1）  洗滌液的準(zhǔn)備：洗滌液是一種40倍濃縮的緩沖液，使用前應(yīng)當(dāng)將洗滌液平衡至室溫，并混合均勻。用1950ml蒸餾水稀釋50ml濃縮洗滌液，混合均勻，這就是即用型的洗滌液。稀釋后的洗滌液應(yīng)當(dāng)儲(chǔ)存于冰箱中至2周

2）  酶標(biāo)抗體的準(zhǔn)備：標(biāo)記抗體是30倍濃縮的，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需要的量，用酶標(biāo)抗體稀釋液將濃縮酶標(biāo)抗體稀釋30倍，稀釋后就可以用了。例如：如果您檢測(cè)8孔，則需要800ul即用型的酶標(biāo)抗體（用870ul酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋30ul濃縮的酶標(biāo)抗體，并混合均勻，使用時(shí)每孔加100ul）。酶標(biāo)抗體應(yīng)當(dāng)在使用前臨時(shí)將其準(zhǔn)備好。剩余的濃縮酶標(biāo)抗體應(yīng)當(dāng)密封儲(chǔ)存于4℃的環(huán)境下。

3）  標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：在試管內(nèi)，用0.5ml蒸餾水稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，并混合均勻，稀釋后ET-1標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為200pg/ml。

4）  標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋準(zhǔn)備9個(gè)試管，在每個(gè)試管中加入230ul EIA緩沖液。每支試管的具體濃度如下：

將230ul標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到試管1中，混合均勻；之后將230ul試管1中的溶液加入到試管2中，將標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)兩倍稀釋來(lái)確定8點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為100pg/ml到0.78pg/ml），EIA緩沖是檢測(cè)樣品空白對(duì)照，濃度為0pg/ml。

如圖：

 

5）  檢測(cè)樣品的稀釋：如果有必要稀釋的話，用EIA緩沖液稀釋檢測(cè)樣品。如果您要用血清、血漿或組織樣做樣品，有必要用Sep-Pak C-18提取柱進(jìn)行預(yù)提取。（見 “樣品處理應(yīng)注意的問(wèn)題”）

在實(shí)驗(yàn)開始大約30分鐘時(shí)，將所有的試劑都平衡至室溫。輕輕的并充分混勻試劑。確保所有試劑都未變質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備應(yīng)當(dāng)與樣品的檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行。

1）  確定好空白孔，并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。

2）  確定好樣品對(duì)照孔，檢測(cè)樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，然后分別將100ul樣品對(duì)照品、檢測(cè)樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的微孔中。

3）  蓋板，4℃下溫育一整夜

4）  用洗滌瓶洗板，在微孔中加入洗滌液再浸泡15-30秒，棄取洗滌液。重復(fù)7次，zui后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機(jī)洗板時(shí)，用洗板機(jī)洗四次后，再用洗滌瓶洗3次。

5）  每一微孔中加入100ul酶標(biāo)抗體。

6）  蓋板，37℃下溫育30min

7）  按照步驟4）洗板9次

8）  將所需量的顯色劑加入到試管中，然后每孔內(nèi)加入100ul顯色劑。為了避免污染，請(qǐng)勿將剩余試劑在倒入顯色劑原裝瓶中。

9）  室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會(huì)變成藍(lán)色

10）              在每一微孔中加入100ul終止液，此時(shí)溶液顏色會(huì)變成黃色。

11）              移去包被孔底的雜質(zhì)或水滴，同時(shí)確保液體表面無(wú)泡沫， 30min內(nèi)在450處讀取OD值。

1.     樣品采集后應(yīng)立即檢測(cè)，如需貯存的，則應(yīng)放置在冰凍條件下，避免反復(fù)凍融，檢測(cè)前應(yīng)在低溫下將其溶解并*混合

2.     如有需要，樣品可用EIA緩沖液稀釋

3.     建議試驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做雙份檢測(cè)

4.     試驗(yàn)樣品應(yīng)在中性PH范圍內(nèi)，有機(jī)溶劑的污染會(huì)影響試驗(yàn)

5.     只能使用試劑盒內(nèi)提供的洗滌液洗板，洗板不充足可能會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗

6.     *倒去洗滌液，吸水紙上拍干，不能用吸水紙擦拭微孔

7.     底物液應(yīng)避光保存，因其對(duì)光敏感，且要避免接觸金屬

8.     加入終止液后30min內(nèi)讀數(shù)

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線前，將所有的檢測(cè)孔（包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品）的OD值都減去檢測(cè)樣品空白孔的OD值。在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值（減去空白后的值）對(duì)其相應(yīng)的濃度，通過(guò)這些點(diǎn)作一條平滑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。我們可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取未知樣品的濃度值。

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線

 

 

附：采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)，只需檢測(cè)前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù)，如坐標(biāo)參數(shù)（線性，半對(duì)數(shù)）和計(jì)算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對(duì)數(shù)曲線方程），即可直接得到結(jié)果

 

直接用于檢測(cè)的樣品所含蛋白濃度低（如細(xì)胞培養(yǎng)液上清，尿液等），但是，抽提物中要求高濃度蛋白（如血漿，血清，組織勻漿等），樣品抽提建議采用Sep-Pak C-18柱：

1. Sep-Pak C-18柱預(yù)處理^（1）

a. 4ml純乙醇沖洗

b. 2ml的去離子水沖洗2次

c. 2ml 0.1%的TFA液沖洗2次

2.樣品預(yù)處理

a. 血漿（血清）-6ml 10%乙酸與2ml血漿混合

b. 組織樣品

（1）組織樣品和勻漿內(nèi)加入1M的乙酸和20mM鹽酸溶液

（2）煮沸10min后，10000rpm下離心10min，收集上清

3. 樣品抽提

a. 樣品加入至Sep-Pak C-18柱

b. 3ml去離子水洗柱3次

c. 用合適的溶液^（2）洗柱收集2ml樣品至瓶?jī)?nèi)

4. 檢測(cè)

采集的樣品應(yīng)凍干和凍存，貯存的樣品用0.1ml的溶液^（3）和0.2ml的EIA緩沖液混合，確保樣品PH在中性范圍內(nèi)。樣品間的回收率存在不同，請(qǐng)?zhí)崆白龌厥赵囼?yàn)

（1）       產(chǎn)品型號(hào)：WAT023501 ,Waters生產(chǎn)

（2）       去離子水里加入0.1%的三氟乙酸^（4）和60%的乙腈

（3）       0.1%三氟乙酸的DMSO

（4）       貨號(hào)：206-10731，日本生產(chǎn)

貯存和穩(wěn)定性

貯存條件：2-8℃

有效期標(biāo)記在外盒上

 

本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。

 

 

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