（日本IBL*，貨號(hào):27734）

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阿爾茨海默病（AD）是德國(guó)神經(jīng)病理學(xué)家A. Alzheimer于1907年公布的,它被*是導(dǎo)致癡呆的主要因素.

此固相ELISA檢測(cè)試劑盒運(yùn)用兩個(gè)高特異性抗體.加入TMB底物液后作為顯色劑.顯色的強(qiáng)度與人的可溶性淀粉樣前體蛋白α（sAPPα）的量成正比.

0.78- 50ng/mL

供研究用,不能用于診斷步驟.

■     此IBL檢測(cè)試劑盒能用于人血清,EDTA血漿,腦脊液,細(xì)胞培養(yǎng)基上清液的sAPP的定量檢測(cè).

■     建議血清樣本，EDTA-血漿樣本稀釋4-8倍.

■     腦脊液樣品超過(guò)4倍.

■     如果細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有血清如FCS，可能會(huì)有交叉反應(yīng)，建議設(shè)置一個(gè)陰性介質(zhì)質(zhì)控

 

1預(yù)包被板:抗人-sAPPα （2B3）小鼠IgG單克隆抗體,親和純化         96T

2濃縮酶標(biāo)抗體 （30X）HRP標(biāo)記的抗人APP（R101A4）小鼠

IgG單抗,Fab’親和純化                                  0.4 mL x 1

3標(biāo)準(zhǔn)品:重組人sAPPα蛋白                                     0.5mL x 2

4EIA緩沖液                                                   30mL x 1

5酶聯(lián)物稀釋液 1%的BSA ,0.05%吐溫20的PBS                   12mL x 1

6底物液:TMB溶液                                             15mL x 1

7終止液: 1N H2SO4                                             12mL x 1

8濃縮洗滌液:40×  0.05%吐溫20的磷酸緩沖液                     50mL x 1

 

酶標(biāo)儀（450nm）                          微量移液管及槍頭

量筒及燒杯                              去離子水

冰箱（4°C）                              坐標(biāo)紙（log/log）

吸水紙                                  試管

洗瓶

用于“2濃縮酶標(biāo)抗體”及“6底物液:TMB溶液”的一次性試管

1）      洗滌液的準(zhǔn)備

“ 8濃縮洗滌液”是一種40倍的濃縮液.放置至室溫后,把50 mL的濃縮液溶于1950 mL的去離子水中制成稀釋洗滌液,置于冰箱中能保存2周.

2）     酶聯(lián)物的準(zhǔn)備

“2濃縮酶標(biāo)抗體”是一種30倍濃縮物,使用一次的試管用“5酶聯(lián)物稀釋液” 稀釋“2濃縮酶標(biāo)抗體”制成所需酶聯(lián)物.（按1:30稀釋）

舉例：如果你使用的是8孔的，那我們需要配置800ul的標(biāo)記抗體，30ul 的“2濃縮酶標(biāo)抗體”和870ul的“ 5酶聯(lián)物稀釋液”混合，每孔加100ul

3）     標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

取0.5 mL的去離子水稀釋瓶裝的”3標(biāo)準(zhǔn)品”,混勻制成100 ng/mL的人sAPPα標(biāo)準(zhǔn)品

4）     標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋

準(zhǔn)備8支試管用于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋并編號(hào).各加230μL ”4EIA緩沖液”于各試管中.取230 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于試管1,混勻.然后再?gòu)脑嚬?中取230 μL溶液放到試管2中,按此規(guī)律,如下圖如示配制系列標(biāo)準(zhǔn)品.第8支試管為0 ng/mL作為零標(biāo)準(zhǔn)品.

 

5）     樣本的稀釋

樣本必需用試劑盒提供的”4EIA緩沖液”稀釋.如果樣本中的sAPPα濃度范圍不清楚,建議預(yù)配制幾種不同濃度來(lái)確定合適的檢測(cè)濃度.

 

將所有的試劑平衡至溫室（大約30分鐘）,使用前混勻.確保試劑無(wú)質(zhì)量問(wèn)題.在檢測(cè)樣本的同時(shí)要準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線.

 

 

1設(shè)試劑空白對(duì)照.加100μL“4EIA緩沖液”于微孔中.

2各加100μL樣本空白（試管8）,系列標(biāo)準(zhǔn)品（試管1-7） ,樣本于相應(yīng)的各孔中.

3在蓋板后在4°C孵育過(guò)夜

4用洗滌液洗板.然后在加入洗滌緩沖液,無(wú)需蓋板放置15-30秒左右,再*移除洗滌緩沖液.此步驟需重復(fù)至少7次. zui后在吸水紙上輕扣去除殘留液滴.

如有用自動(dòng)洗板機(jī),在洗板機(jī)上洗板4次后,上述的人工洗滌步驟仍需重復(fù)3次

5各加100 μL酶聯(lián)物溶液于各孔中.

6蓋板后在4°C下孵育30分鐘

7按步驟4洗板9次.

8加所需量的“6底物液:TMB溶液”至一次性的試管中.再各取100 μL底物液于相應(yīng)各孔中.注意一次性試管內(nèi)的多余底物液切勿倒回瓶中,避免交叉感染.

9避光在室溫下孵育包被板30分鐘.加入底物液后,孔內(nèi)的液體會(huì)變成藍(lán)色.

10各加100μL“7終止液”至各孔中,輕扣板條混勻.加入終止液后孔內(nèi)的液體會(huì)變成黃色.

11去除板底的污垢或液滴,確保無(wú)氣泡形成,在加入終止液后30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)其吸光度值.

 

1樣本收集后應(yīng)立即檢測(cè).如是冷凍儲(chǔ)存的樣本,則需解凍,避免反復(fù)凍融.

2樣本必需用“4EIA緩沖液”稀釋.

3建議樣本和各標(biāo)準(zhǔn)品做雙份檢測(cè)

4樣本應(yīng)保持在中性PH范圍內(nèi).因?yàn)橛袡C(jī)溶劑的污染會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果

5只可以用試劑盒提供的洗滌緩沖液用于洗板,不充足的洗板可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果.

6在吸水紙上輕扣板去除殘留液滴.切勿用吸水紙刮擦微孔.

7“6底物液”需避光保存,避免讓其與金屬接觸.

8加“ 7終止液”后,30分鐘內(nèi)必需讀數(shù).

 

所有的測(cè)量的吸光度值（包括標(biāo)準(zhǔn)品,未知檢測(cè)樣本）都需減去空白對(duì)照的吸光度值.在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo),以相對(duì)應(yīng)的吸光度作為縱坐標(biāo),通過(guò)光滑的點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.檢測(cè)樣品的濃度可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取.

 

 

 

以上的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例演示,不能用于樣本結(jié)果的讀取.每次檢測(cè)都必需建立其標(biāo)準(zhǔn)曲線.

 

 

 

本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。

 

 

 

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